把要退火的DNA oligo用經(jīng)滅菌的三蒸水配制成50μM。解凍Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)，混勻備用。如經(jīng)常使用，本Buffer可放置2-8℃一個(gè)月。
2. 如下設(shè)置退火反應(yīng)體系：
| Annealing Buffer for DNA Oligos(5X) | 20μl | | DNA oligo A(50μM) | 20μl | | DNA oligo B(50μM) | 20μl | | Nuclease-Free Water | 40μl | | 總體積 | 100μl |
按照上述順序依次加入各種試劑，混勻。放入PCR儀。
3. 如下設(shè)置PCR儀進(jìn)行退火反應(yīng)： | 步驟 | 溫度 | 時(shí)間 | 說(shuō)明 | | 1 | 95℃ | 2分鐘 | 讓oligo充分變性 | | 2 | 每8秒下降0.1℃，降25℃(注1) | 約90分鐘 | 退火 | | 3 | 4℃ | 長(zhǎng)時(shí)間保持 | 暫時(shí)存放 |
注1：如果所用的PCR儀不具備下降0.1℃的功能，也可以設(shè)置為每90秒下降1℃。
4. 退火結(jié)束后可以直接用于連接反應(yīng)，也可以在-20℃凍存?zhèn)溆?。如果退火結(jié)束后打算進(jìn)行酶切等其它反應(yīng)，好用純化試劑盒進(jìn)行純化，或者確保退火產(chǎn)物在反應(yīng)體系中體積不超過(guò)10%，以避免AnnealingBuffer對(duì)后續(xù)的酶反應(yīng)體系的干擾。 |
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