核蛋白抽提試劑盒 對于體外培養(yǎng)細(xì)胞：
1．根據(jù)用量取適當(dāng)?shù)臐{蛋白抽提試劑和核蛋白抽提試劑加入 PMSF，使 PMSF 的終濃度為 1mM。PMSF
需現(xiàn)用現(xiàn)加，若目標(biāo)蛋白含有豐富的半胱氨酸，可以在兩種蛋白抽提液中加入 DTT 終濃度 0.5mM。
2．對于貼壁細(xì)胞，去除培養(yǎng)液，用 PBS 洗一遍，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，或用 EDTA 消化后吹打下細(xì)胞（好不用胰酶硝化，以免過度消化蛋白）。500 g 離心 2～3 分鐘收集細(xì)胞，吸盡上清留下沉淀備用。
3．對于懸浮細(xì)胞：用 PBS 洗一遍，500 g 離心 2～3 分鐘收集細(xì)胞，吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
4．按照每 20ul 細(xì)胞沉淀加入 200ul 漿蛋白抽提試劑的比例加入裂解液。
5．高速劇烈渦旋 15 秒，使細(xì)胞*分散開。若沉淀沒有*分散，可以適當(dāng)延長渦旋時間。
6．500 g 離心 2～3 分鐘，去上清。
7．加入漿蛋白抽提試劑 200ul，高速劇烈渦旋 5 秒，冰浴 10 分鐘。
8．高速劇烈渦旋 5 秒，4℃12000～16000g 離心 10 分鐘。
9．上清即為抽提得到的細(xì)胞漿蛋白?？蛇M(jìn)行后續(xù)的 PAGE、Western，但蛋白濃度很低，可能需要濃縮。
10．*吸盡殘余的上清，避免細(xì)胞漿蛋白污染，加入 100ul 核蛋白抽提試劑。
11．高速渦旋 15 秒或用移液器吹打*分散,放回冰浴中 5 分鐘，4℃12000～16000g 離心 10 分鐘。
12．立即吸取上清預(yù)冷的樣品管中，此即為抽提得到的細(xì)胞核蛋白?？蛇M(jìn)行后續(xù)實驗或-70℃凍存。
對于組織樣品：
把組織稱重后，盡可能切成非常細(xì)小的碎片，按每 50mg 組織加入 200ul-500ul PBS，用勻漿器冰上勻漿勻漿制成細(xì)胞懸液，500 g 離心 2～3 分鐘收集細(xì)胞，吸盡上清，收集沉淀。加入 200ul 漿蛋白抽提試劑后接上述步驟 5 |
點擊放大
