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真菌基因組DNA提取試劑盒說明書
 真菌是具有真核和細胞壁的異養(yǎng)生物。種屬很多，已報道的屬達1萬以上，種超過10萬個。真菌通常又分為三類，即酵母菌、霉菌和蕈菌（大型真菌）。對于酵母菌和霉菌，可以用玻璃珠處理，而對于大型真菌，可直接用液氮研磨。經(jīng)過前期處理的菌液，用硅質(zhì)膜吸附，即可得到高純度的基因組。提取純化后的DNA，可以直接用于 PCR/Real time-PCR，sequencing，Southern blot，mutant analysis，SNP 等下游應(yīng)用實驗。
操作步驟： 使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。 1、樣品的處理： 1）對于酵母菌，取1-2ml培養(yǎng)好的菌液，離心收集，棄上清。加入200ul 溶液A，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約5-10min。 2）霉菌(孢子也可相同處理)：取50-100mg菌絲，加200ul溶液A，用玻璃研磨器適當(dāng)研磨分散菌絲，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約30min。 3）大型真菌（如蘑菇等）：稱取50-100mg樣品，倒入適量的液氮，立即研磨重復(fù)3 次，使樣品研成粉末（如無液氮，可加200ul溶液A后用玻璃研磨器適當(dāng)研磨），加200ul溶液A，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩，約5min。 2、加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混勻，55℃水浴消化，30min。消化期間可顛倒離心管混勻數(shù)次，12000rpm離心2min。將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中。如有沉淀，可再次離心。 3、在上清中加入200ul溶液B，充分混勻。如出現(xiàn)白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即會消失，不影響后續(xù)實驗。如溶液未變清亮，說明樣品消化不*，可能導(dǎo)致提取的DNA量少及不純，還有可能導(dǎo)致上柱后堵
柱子，請增加消化時間。 4、再加入200ul無水乙醇，充分混勻，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，不影響DNA的提取，將溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，放置2分鐘。 5、12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 8、12000rpm離心2min，將吸附柱置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續(xù)的實驗如酶切、PCR等。 9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加50-200ul經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心1min。 10、離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，即可得到高質(zhì)量的基因組DNA。
注意事項： 1. 由于真菌種類萬千，對于一些特別難處理的真菌，可用液氮研磨，再用玻璃珠振蕩，蛋白酶K處理，一般都可以得到一定量的基因組DNA，如電泳檢測很弱，一般PCR都會有較好結(jié)果。 2. 若溶液A或溶液B中有沉淀，可在55℃水浴中重新溶解。 3. 如果DNA提取量很少，可加長玻璃珠處理時間，如果提取DNA成彌散短條帶，可減少玻璃珠處理時間。 4. 洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。 5. DNA濃度及純度檢測：得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關(guān)?；厥盏玫降腄NA段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50 μg/ml雙鏈DNA、40 μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。 6. 在確保樣品無誤的情況下，如經(jīng)過多次試驗，都無法提出DNA，請將部分樣品寄我公司，我們代為摸索優(yōu)化條件，以使您的實驗?zāi)軌蛘＿M行下去。
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