產(chǎn)品介紹

T4多聚核苷酸激酶(T4PNK)能夠催化ATP的γ-位磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到寡核苷酸鏈（雙鏈或單鏈DNA或RNA）的5’-羥基末端以及3’-單磷酸核苷上。T4多聚核苷酸激酶還具有3’磷酸酶活性，將3’-磷酸基團(tuán)從寡核苷酸的3’磷酸末端、脫氧3’-單磷酸核苷和脫氧3’-二磷酸核苷上水解掉。該酶經(jīng)修飾后，其3’磷酸酶活性缺失，但仍保留了所有激酶的活性。

應(yīng)用

1.DNA或RNA5′末端的磷酸化，以便進(jìn)行連接反應(yīng)。

2.DNA或RNA的末端標(biāo)記，用作探針和進(jìn)行DNA

測序

3.將3′端已經(jīng)磷酸化的單核苷酸5′磷酸化，制備

pNp底物，用于添加到DNA或RNA的3′端

4.對3′端有磷酸基團(tuán)的寡核苷酸的5′端進(jìn)行標(biāo)記

注意事項(xiàng)

（1）1×T4多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液：70mMTris-HClpH

7.6，10mMMgCl2，5mMDTT，37°C溫育。

（2）熱失活：65°C加熱20分鐘。

（3）在放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，可用1×T4多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液、50pmol的γ-[32P]ATP和20單位的酶37℃溫育30分鐘。

（4）T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能發(fā)揮活性，但是為了適用于高活力的放射性標(biāo)記反應(yīng)，在隨酶提供的反應(yīng)緩沖液中不含ATP。因此在磷酸化修飾核酸時(shí)請單獨(dú)添加終濃度0.5~1mMATP。

（5）要提高平齊末端或5’凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶前，先將DNA溶液于70°C加熱5分鐘，然后冰上冷卻，并加入5%（W/V）的PEG-8000。

（6）一般來說，進(jìn)行激酶反應(yīng)之后是連接反應(yīng)。在這種情況下，T4多聚核苷酸激酶反應(yīng)在連接酶反應(yīng)緩沖液中37°C溫育30分鐘即可。反應(yīng)后的產(chǎn)物可直接進(jìn)行連接，無需改變緩沖液和進(jìn)行熱失活。如果連接時(shí)需要保持其它DNA片段的去磷酸化狀態(tài)，則需要在連接反應(yīng)前熱失活T4多聚核苷酸激酶。

T4多聚核苷酸激酶(3’磷酸酶活性缺失)

T4多聚核苷酸激酶(3’磷酸酶活性缺失)