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promega M1701 使用說(shuō)明


說(shuō)明


Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase(MMLV RT,M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶) 是一種RNA 依賴的DNA 聚合酶,可用于長(zhǎng)mRNA (>5kb) 為模板的cDNA 合成。該酶是M-MLV 的pol 基因產(chǎn)物,由一個(gè)分子量為71kDa 的亞單位組成。M-MLV RT 的RNase H 活性比常用的鳥類成髓細(xì)胞性白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus,AMV) 逆轉(zhuǎn)錄酶弱。


特點(diǎn)


提供5× 反應(yīng)緩沖液:250mM Tris-HCl (pH 8.3,25℃ ),375mM KCl,15mM MgCl2,50mM DTT。

高溫失活:在70℃加熱M-MLV RT 10 分鐘滅活。



儲(chǔ)存條件

儲(chǔ)存于-20℃。


產(chǎn)品目錄號(hào):  M1701 M1705 
 
 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶簡(jiǎn)明操作步驟 
 cDNA*鏈合成操作步驟: 
請(qǐng)使用者準(zhǔn)備: 
z 重組 RNasin?核酸酶抑制劑 (目錄號(hào) N2511) 
z dATP,10mM
z dCTP,10mM
z dGTP, 10mM
z dTTP, 10mM 
z 無(wú)核酸酶的水 
 
1. 在一支無(wú)核酸酶污染的小離心管中加入: RNA 2ug 引物 1ug 無(wú)核酸酶水補(bǔ)齊 15ul 加熱離心管到 70℃,5 分鐘,這樣可以打開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后立即在冰上冷卻,以避免重新形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。短暫離心,使溶液歸于管底。 
 
2. 按以下順序在復(fù)性的引物/模板管(即以上小離心管)
中加入下列組分: 
注意:不要改變引物與 mRNA的比例。 
M-MLV 5XReaction Buffer 5ul 
dATP,10mM 1.25ul 
dCTP,10mM 1.25ul 
dGTP, 10mM 1.25ul 
dTTP, 10mM 1.25ul 
重組 RNasin?核酸酶抑制劑 25units M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 200units 加無(wú)核酸酶水補(bǔ)齊 25ul 
 
3. 輕彈離心管混合溶液。若使用隨機(jī)引物,在 37℃孵育 60分鐘進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng);若使用其它引物(Oligo (dT)或基因特異引物),則在 42℃孵育 60分鐘進(jìn)行反應(yīng)。 
 
4. 第二條鏈合成可使用您選擇的操作方法,也可參考: 
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 8.64. 
 
注意:M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶緩存液與許多下游應(yīng)用相容。在進(jìn)行第二鏈合成或 PCR 之前,一般無(wú)需使用酚抽提及乙醇沉淀純化合成的*鏈 cDNA。 

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