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鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用說明

鼠尾膠原蛋白Ⅰ型使用說明
貨號:C8062
保存:4℃保存,切勿凍存,有效期為一年。
規(guī)格:10mg, 5mg/ml, 溶解于 0.006mol/L HAc, 無菌。
產(chǎn)品簡介:
索萊寶鼠尾膠原蛋白 I型(rattailtendon collagen type I)是通過 Birkedal-Hansen的方法,通過醋酸抽提、氯化鈉沉淀、磷酸氫二鈉沉淀等步驟制備的。本公司鼠尾膠原蛋白可用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器皿,培養(yǎng)一些在普通細(xì)胞培養(yǎng)器皿中不易貼壁的細(xì)胞。也可用于制備三維膠,模擬真實(shí)的生長環(huán)境,使細(xì)胞在三維環(huán)境中生長。
1,在使用索萊寶鼠膠原蛋白I型包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中檢查到PC-12細(xì)胞的貼壁和生長。
2,在 1mg/ml濃度以上,pH為7左右時(shí)可形成具有一定強(qiáng)度的三維膠,檢查到NIH-3T3細(xì)胞在三維膠內(nèi)正常生長、PC-12細(xì)胞在三維膠表面正常生長。
使用方法:
1、細(xì)胞培養(yǎng)器皿的表面包被推薦濃度: 1-5ug/cm2
以包被濃度為 2 ug/cm2 為例:用無菌0.006mol/L(0.36g/L) 乙酸將膠原蛋白稀釋到0.012mg/ml。
按以下表格體積加到相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中:

按以下表格體積加到相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中:
                  表面積(cm2 ,每孔或每皿)        加入 0.012mg/ml 膠原的體積( ul )
96孔細(xì)胞培養(yǎng)板           0.3                                50
24孔細(xì)胞培養(yǎng)板           1.9                                300
12孔細(xì)胞培養(yǎng)板           3.8                                600
6孔細(xì)胞培養(yǎng)板            9.5                                1580
35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿           8                                  1330
60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿          21                                  3500
100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿         55                                  9170
確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面,開蓋在超凈臺(tái)上過ye晾干。也可以在室溫放置 1小時(shí)后,用PBS洗3-4次后直接使用。包被好的器皿在 4-25℃少可保存3個(gè)月以上的時(shí)間。
2、三維膠原的制備
鼠尾膠原蛋白I型在濃度1mg/ml以上,pH 7左右時(shí)可形成具有一定強(qiáng)度三維膠,建議成膠濃度1-2mg/ml。膠原蛋白溶解于0.006mol/L 乙酸中,在成膠過程中需要加入0.06×體積的 0.1mol/L NaOH 來中和。
需要的溶液(均需要無菌、預(yù)冷):10×PBS(可含10 mg/L的酚紅用于 pH 指示)或 10×培養(yǎng)液,, 0.1mol/L NaOH,0.1mol/L 乙酸(一般不用),雙蒸水
A. 不含細(xì)胞的三維膠原的制備(以配制1毫升,1mg/ml三維膠為例):將200ul鼠尾膠原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的離心管中,加入 690ul H2O。然后加到12ul 0.1mol/L NaOH中(如果反過來把12ul 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中,會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)),立即混勻。再加入100ul 10×PBS
或10×培養(yǎng)液,混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中(混勻后pH為7左右,如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅,初次使用時(shí)需要用pH試紙測試)。將培養(yǎng)器皿在室溫(25度左右)下放置20分鐘待膠凝固后,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。如果配制中使用的是10×PBS,使用前需要加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液預(yù)平衡。
B.含細(xì)胞的三維膠原的制備(以配制1毫升,1mg/ml三維膠為例):準(zhǔn)備好懸浮于培養(yǎng)液的細(xì)胞,并放置于冰浴中。將200ul鼠尾膠原蛋白I型 (5mg/ml)加到12ul 0.1mol/L NaOH中(如果反過來把12ul 0.1mol/L NaOH加到膠原溶液中,會(huì)由于NaOH不能迅速混勻而產(chǎn)生局部的膠原凝結(jié)),立即混勻。再加入23ul 10×PBS或10×培養(yǎng)液,混勻(混勻后pH為7左右,如果PBS或培養(yǎng)液中沒有加酚紅,初次使用時(shí)需要用pH試紙測試)。加入760ul的細(xì)胞懸浮液,混勻后立即加到培養(yǎng)器皿中。將培養(yǎng)器皿在室溫下放置20分鐘待膠凝固后,加入適當(dāng)體積的細(xì)胞培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
注意事項(xiàng):
鼠尾膠原蛋白I型在室溫下pH中性時(shí)可迅速成膠,在操作過程中要盡量保持低溫。

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