----Taq DNA聚合酶

在PCR反應(yīng)中，毫無疑問的DNA聚合酶是最關(guān)鍵的因素。PCR最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶 I的Klenow片段。但該酶存在很多缺陷，使之不能廣為應(yīng)用，比如：熱穩(wěn)定性差，每次DNA熱變性后大部分酶都被滅活，需要重新加入，每個(gè)循環(huán)都要重新加入；Klenow酶反應(yīng)溫度較低，引物和模板容易形成非特異性配對(duì)，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。后來人們?cè)褂眠^T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，兩者雖使擴(kuò)增特異性增加，且使DNA合成速度提高了，但是由于其對(duì)熱的穩(wěn)定性差而未能廣泛應(yīng)用。直到耐熱的DNA聚合酶發(fā)現(xiàn)，才使得PCR技術(shù)得到迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。

Taq DNA 聚合酶是從一種嗜熱水生菌Thermus aquaticus YT-1菌株中分離提純得到的。是1969見從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離得到的，它生長(zhǎng)在70～75℃極富礦物質(zhì)的環(huán)境中。

Taq DNA 聚合酶基因全長(zhǎng)為2496堿基，編碼832個(gè)氨基酸，酶蛋白分子量為94KD。該酶在70～75℃時(shí)具有最高的生物活性。75～80℃條件下每一個(gè)酶蛋白分子每秒可延伸約150個(gè)堿基。70℃時(shí)，酶分子延伸速率每秒在60個(gè)堿基以上。溫度降低時(shí)，延伸速率明顯下降。55℃時(shí)為每秒22個(gè)堿基，37℃時(shí)約每秒1.5個(gè)堿基，22℃時(shí)約每秒0.25個(gè)堿基。當(dāng)溫度超過80℃時(shí)，合成速度也明顯下降，這可能和引物或引物-模板復(fù)合物的穩(wěn)定性遭到破壞有關(guān)。

Taq DNA 聚合酶具有良好的熱穩(wěn)定性。曾有測(cè)試：在92.5℃、95℃、97.5℃下，Taq DNA 聚合酶的生物半衰期分別為130分鐘、40分鐘和5～6分鐘。與大腸桿菌DNA聚合酶I相比較，Taq DNA 聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，缺乏3’→5’外切酶活性。因此，在PCR反應(yīng)中如果發(fā)生某些氨基酸的錯(cuò)配，這種酶是沒有修正功能的。使用Taq DNA聚合酶的PCR反應(yīng)出現(xiàn)堿基錯(cuò)配的幾率為2.1×10-4左右。

和其他許多聚合酶一樣，Taq DNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感。以鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8 mmol/L時(shí)，用不同濃度Mg2+進(jìn)行PCR反應(yīng)10min，測(cè)定結(jié)果為MgCl2濃度在2.0 mmol/L時(shí)該酶催化活性最高，此濃度能最大限度地激活Taq DNA聚合酶的活性，Mg2+過高就抑制酶活性，當(dāng)MgCl2濃度在10 mmol/L時(shí)可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離的Mg2+濃度，因而MgCl2的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整。一般反應(yīng)中Mg2+濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L。另外適當(dāng)濃度的KCl能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)明顯抑制該酶的活性。