文獻(xiàn)背景
富勒烯衍生物具有顯著的抗腫瘤作用和廣泛的安全性。羥基化富勒烯通過(guò)重塑腫瘤微環(huán)境（TME）抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，包括抗氧化防御、免疫激活、血管生成破壞、消除癌癥干細(xì)胞以及調(diào)節(jié)癌蛋白的表達(dá)和活性。乙二胺（EDA）修飾的[70]富勒烯（C70-EDA）可以靶向mRNA結(jié)合蛋白和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，激活自噬通量，誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯直接抑制癌細(xì)胞。但C70-EDA的分子結(jié)構(gòu)尚不明確，使探索其抗腫瘤作用具有挑戰(zhàn)性。
作者合成了三種[60]富勒烯兩親性衍生物：四[4-（氨基）哌啶-1-基]C60環(huán)氧化物（TAPC-4）、三[4-（氨基）哌啶-1-基]-氫-C60環(huán)氧化物（TAPC-3）和四[4-（羧基）哌啶-1-基）C60環(huán)氧化物（TCPC-4）。TAPC-4可通過(guò)G0/G1細(xì)胞周期阻滯直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，并通過(guò)抑制細(xì)胞遷移和逆轉(zhuǎn)EMT來(lái)阻止腫瘤轉(zhuǎn)移。與TAPC-4相比，TAPC-3具有高抑制作用，但其抗腫瘤效果較低。TAPC-4可結(jié)合熱休克蛋白Hsp90β、波形蛋白和MYH9分別調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、EMT和細(xì)胞遷移率。探索TAPC-4與Hsp90β、波形蛋白和MYH9的結(jié)合模式，進(jìn)一步闡明TAPC-4的特殊抗腫瘤機(jī)制。
基本信息
摘要
惡性增殖和轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞的特征。胺化[70]富勒烯具有顯著的抗腫瘤作用，使其成為多靶向抗癌藥物的候選藥物?？鼓[瘤胺化富勒烯的構(gòu)效關(guān)系是一項(xiàng)迫切需要研究的課題。本文合成了三種分子結(jié)構(gòu)明確的[60]富勒烯兩親性衍生物：TAPC-4、TAPC-3和TCPC-4。TAPC-4通過(guò)G0/G1細(xì)胞周期阻滯抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，消除腫瘤細(xì)胞的高遷移性。TAPC-4可從機(jī)體排出體外，對(duì)腫瘤增殖的體內(nèi)抑制指數(shù)為75.5%，對(duì)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的體內(nèi)抑制指數(shù)為87.5%，安全裕度較大。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，兩親性分子結(jié)構(gòu)和末端氨基促進(jìn)TAPC-4靶向熱休克蛋白Hsp90β、波形蛋白和肌球蛋白重鏈9（MYH9），可能導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的翻譯、波形蛋白的表達(dá)和MYH9定位改變。這項(xiàng)工作強(qiáng)調(diào)了兩親性結(jié)構(gòu)和末端氨基在胺化富勒烯抗腫瘤作用中的主導(dǎo)作用，為其抗腫瘤藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
研究結(jié)果與討論
1.[60]富勒烯的兩親性衍生物體外抑制腫瘤增殖
采用一步法合成TCPC的叔丁氧羰基（Boc）和叔丁酯保護(hù)的TAPC-4和TAPC-3（圖1a）。TAPC-3、TAPC-4和TCPC-4在水溶液中平均zeta電位分別為41.4、43.1和?40.1 mV（圖1b）。TAPC-3、TAPC-4和TCPC-4的統(tǒng)計(jì)粒度分布分別為8.2±4.3、6.3±3.5和12.7±5.0 nm（圖1c），兩親性富勒烯衍生物在水溶液中自組裝形成納米簇。PEG-PO涂層的TAPC-3和TAPC-4在各種癌細(xì)胞中的IC50約為10 μm，TCPC的IC50在20到90 μM之間（圖1d，e）。L-02和HUVEC中TAPC-3和TAPC-4的IC50增加至約16 μM，表明其對(duì)正常細(xì)胞的抑制作用減弱。由于TAPC-4具有顯著的抗腫瘤功效且產(chǎn)率遠(yuǎn)高于TAPC-3，因此選擇TAPC-4進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。
作者分別用TAPC-4（10μm）和PBS（NC）處理A549細(xì)胞24小時(shí)，共鑒定和定量6487種蛋白質(zhì)。已獲得具有最小p值的前幾個(gè)GO項(xiàng)（圖1f）。A549和DU145細(xì)胞與濃度高達(dá)10 μM的PEG-PO包被的TAPC-4孵育24小時(shí)，G0/G1期細(xì)胞的比例從50%提高到70%（圖1g）。TAPC-4劑量依賴性地誘導(dǎo)Cyclin D1和磷酸化RB（pRB）的下調(diào)（圖1h）。與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的差異蛋白上生成了蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)（圖1i）。這些蛋白質(zhì)中的大多數(shù)對(duì)細(xì)胞周期蛋白質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)。TAPC-3和TAPC-4的抗腫瘤效果比TCPC-4更高。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明TAPC-4通過(guò)下調(diào)Cyclin D1進(jìn)而降低RB的磷酸化，使細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，C70-EDA可誘導(dǎo)G0/G1期阻滯。TAPC分子結(jié)構(gòu)清晰，具有良好的抗腫瘤活性，更適合于藥物開發(fā)。
圖1
2.TAPC-4抑制癌細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)MET
高遷移率和EMT是癌癥轉(zhuǎn)移的標(biāo)志。Transwell實(shí)驗(yàn)表明TAPC-3和TAPC-4可顯著降低腫瘤細(xì)胞的遷移率（圖2a）。TAPC-4增加了A549和DU145細(xì)胞中上皮標(biāo)志物（E-鈣粘蛋白）的表達(dá)，并降低了間充質(zhì)標(biāo)志物（波形蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Snail、N-鈣粘蛋白）mRNA的表達(dá)水平（圖2b）。TAPC-4劑量依賴性地降低A549和DU145細(xì)胞中波形蛋白和N-鈣粘蛋白的蛋白表達(dá)，如Western（圖2c）和免疫熒光（圖2d）所示。因此，TAPC-4促進(jìn)了間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（MET），這是EMT的逆轉(zhuǎn)過(guò)程。一種原癌基因蛋白Myc被顯著下調(diào)，其調(diào)節(jié)波形蛋白的表達(dá)以及EMT誘導(dǎo)和細(xì)胞遷移的相關(guān)途徑。波形蛋白的下調(diào)通過(guò)反饋來(lái)降低轉(zhuǎn)錄因子Snail的mRNA和蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子Snail通過(guò)抑制E-鈣粘蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)EMT，減少細(xì)胞連接，增加細(xì)胞遷移。
圖2
3.TAPC-4靶向特異性腫瘤調(diào)節(jié)劑
TAPC-4標(biāo)記了D-生物素得到了兩個(gè)產(chǎn)率相當(dāng)?shù)纳锼鼗疶APC-4異構(gòu)體，圖中為熱力學(xué)穩(wěn)定性相對(duì)較高的一種（圖3a）。Hsp90β，波形蛋白和MYH9可能是TAPC-4抑制腫瘤的靶點(diǎn)（圖3c），其在1-3帶MS評(píng)分最高，在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和EMT過(guò)程中起關(guān)鍵作用。TAPC-4與Hsp90、波形蛋白和MYH9的特異性結(jié)合相互作用通過(guò)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖3d）。TAPC-4誘導(dǎo)Cyclin D1表達(dá)下調(diào)和隨后的G0/G1細(xì)胞周期停滯（圖1h），表明TAPC-4與Hsp90的特異性相互作用可能通過(guò)PI3K/AKT途徑抑制Cyclin D1的翻譯。TAPC-4可能通過(guò)蛋白水解途徑結(jié)合波形蛋白并下調(diào)波形蛋白表達(dá)（圖2b-d）。TAPC-4與MYH9的結(jié)合并沒有改變其蛋白表達(dá)（圖3e），而是使MYH7從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞邊緣，從而消除了腫瘤細(xì)胞的流動(dòng)性（圖3f）。
TAPC-4和TCPC-4與Hsp90β的疏水基團(tuán)結(jié)合主要是由于富勒烯碳籠和疏水基團(tuán)間的疏水相互作用（圖3g）。TAPC-4的氨基與HSP90的親水殘基形成多個(gè)氫鍵和靜電相互作用，促進(jìn)TAPC-4獲得比TCPC-4更多的負(fù)靜電能，增強(qiáng)與Hsp90β的結(jié)合（圖3h）。兩親性TAPC-4和TCPC-4都能與Hsp90β，波形蛋白和MYH9通過(guò)富勒烯碳籠與蛋白質(zhì)的疏水相互作用結(jié)合，TAPC-4的末端氨基酸部分可以與親水性氨基酸殘基形成固體靜電相互作用以增強(qiáng)其與靶蛋白的結(jié)合。因此，兩親性分子結(jié)構(gòu)和末端氨基使TAPC-4能夠與Hsp90β，波形蛋白和MYH9結(jié)合，這可能使其在體外具有高抗腫瘤功效。
圖3
4.TAPC-4在體內(nèi)的分布和排泄
BALB/c小鼠分別經(jīng)腹腔注射Cy5.5和Cy5.5標(biāo)記的TAPC-4（TAPC-Cy5.5）。取小鼠的主要臟器（心、肝、脾、肺、腎）在不同時(shí)間間隔（1.5~96h為短期，30d為長(zhǎng)期）進(jìn)行體外成像。游離Cy5.5積累在6小時(shí)達(dá)到最大值，大部分在96小時(shí)內(nèi)被快速排泄。TAPC-Cy5.5的熒光強(qiáng)度在6小時(shí)左右達(dá)到非常高的水平，隨后逐漸下降，30天后基本消失，表明TAPC-4可以被排出體外。TAPC-Cy5.5和游離Cy5.5主要分布在肝、腎、肺和脾。與Cy5.5在72 h內(nèi)被快速清除相比，TAPC-Cy5.5在30 h內(nèi)在腎、肺和脾中重新分布，并緩慢排出，72 h時(shí)只有少量排出，30 d后大部分排出。有報(bào)道稱水溶性富勒烯衍生物在肝、脾、肺和腎中積累，一個(gè)月后可從體內(nèi)清除，這與TAPC-4的分布和排泄一致?？傊?，TAPC-4主要分布在肝、脾、肺和腎中，并在幾天后排出，避免了長(zhǎng)期毒性。
圖4
5.TAPC-4抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)
在治療中未觀察到體重和主要臟器（心、肝、脾、肺和腎）重量的顯著變化，表明PEG-PO修飾后TAPC-4具有較高的生物相容性（圖5b）。PEG-PO在最大劑量下也不會(huì)引起腫瘤體積和腫瘤重量的變化，因此其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用可忽略不計(jì)（圖5c，d）。TAPC-4對(duì)腫瘤組織的收縮呈劑量依賴性，高劑量時(shí)對(duì)腫瘤體積變化的抑制指數(shù)達(dá)到75.5%。腫瘤切片的TUNEL和H&E染色顯示TAPC-4誘導(dǎo)腫瘤廣泛壞死（圖5e）。主要臟器（心、肝、脾、肺和腎）的H&E染色切片未見組織學(xué)損傷，表明TAPC-4在體內(nèi)有效劑量下具有較高的安全性。荷瘤小鼠體內(nèi)顯著升高的白細(xì)胞數(shù)量在TAPC-4治療后下降到正常范圍。TAPC-4降低了Cyclin D1的蛋白水平，消除了腫瘤組織中RB的磷酸化，表明TAPC-4可以誘導(dǎo)G0/G1細(xì)胞周期阻滯，抑制體內(nèi)腫瘤增殖。腫瘤組織中E-鈣粘蛋白上調(diào)、波形蛋白和N-鈣粘蛋白下調(diào)（圖5f），表明EMT通過(guò)TAPC-4被逆轉(zhuǎn)。因此，安全范圍內(nèi)的TAPC-4可在體內(nèi)外通過(guò)阻斷G0/G1期獲得顯著的抗腫瘤作用。
圖5
6.TAPC-4抑制體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移
B16-F10-Luc細(xì)胞靜脈植入BALB/c小鼠中誘導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。每隔一天向小鼠靜脈注射100 μL生理鹽水、PEG-PO和PEG-PO包被的TAPC-4（圖6a）。在對(duì)照組中觀察到強(qiáng)烈熒光和大量肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，表明轉(zhuǎn)移率相對(duì)較高（圖6b-d）。TAPC-4治療時(shí)，黑色素瘤的發(fā)光強(qiáng)度下降，具有良好的治療效果（圖6c）。TAPC-4使肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的平均數(shù)量從40個(gè)減少到5個(gè)，抑制指數(shù)達(dá)到了87.5%（圖6e）。給藥24小時(shí)后，TAPC-4在肺、脾和肝中富集（圖6f），小鼠體重未下降，表明TAPC-4具有良好的生物相容性。因此，TAPC-4在體內(nèi)外通過(guò)逆轉(zhuǎn)EMT對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移具有顯著的抗腫瘤作用。
圖6
結(jié)論
為探索抗腫瘤胺化富勒烯的構(gòu)效關(guān)系合成三個(gè)[60]富勒烯的衍生物，TAPC-4可下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)，抑制RB磷酸化，阻斷G0/G1細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。氨基基團(tuán)較少的TAPC-3具有同樣高的抗腫瘤作用。具有相同分子構(gòu)型但末端氨基被羧基取代的TCPC-4抗腫瘤作用較低。TAPC-4在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制指數(shù)為75.5%，對(duì)原發(fā)器官無(wú)組織損傷，具有較高的抗腫瘤療效和生物安全性。TAPC-4可抑制腫瘤細(xì)胞的流動(dòng)性和EMT增加，對(duì)肺轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的抑制指數(shù)達(dá)到87.5%。腫瘤特異性Hsp90β、波形蛋白和MYH9被篩選為TAPC-4的靶點(diǎn)。兩親性分子結(jié)構(gòu)和末端氨基促進(jìn)了TAPC-4與Hsp90β、波形蛋白和MYH9的結(jié)合，可能分別抑制了Cyclin D1的翻譯和抑制細(xì)胞的G0/G1期阻滯，波形蛋白表達(dá)下調(diào)逆轉(zhuǎn)EMT和通過(guò)MYH9的亞細(xì)胞運(yùn)輸來(lái)抑制細(xì)胞遷移。因此，胺化富勒烯的抗腫瘤作用由兩親性結(jié)構(gòu)和末端氨基共同主導(dǎo)，這為多靶向抗腫瘤藥物開發(fā)提供了基本見解和新策略。
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