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教你成為平淡無(wú)奇的WB實(shí)驗(yàn)小能手—樣本制備篇(續(xù))

 WB實(shí)驗(yàn)流程

 

 

 

樣本制備的步驟

 

 

關(guān)于樣本采集和保存,蛋白提取的相關(guān)

知識(shí)和技巧請(qǐng)查看:

 

接下來(lái),讓小編帶您總結(jié)關(guān)于蛋白定量和蛋白變性相關(guān)的知識(shí)點(diǎn):

 

蛋白定量

測(cè)定蛋白常用的方法有Bicinchoninic acid (BCA)法Lowry法Bradford法(考染法)

 
 

1. BCA法的測(cè)定原理是蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子,后者在堿性溶液中與BCA結(jié)合生成紫紅色結(jié)合物,該復(fù)合物在562nm處有吸光值且與蛋白質(zhì)濃度成正相關(guān)性,據(jù)此可測(cè)定蛋白質(zhì)濃度??捡R斯亮藍(lán)在游離狀態(tài)下呈紅色,大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?,蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比,因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

 
 

 

 
 

2. Lowry法又稱為Folin-酚試劑法,首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復(fù)合物,然后這一復(fù)合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚上級(jí)),產(chǎn)生鉬藍(lán)和鎢藍(lán)復(fù)合物的深藍(lán)色,這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745~750nm處有大的吸收峰,顏色的深淺(吸收值)與蛋白質(zhì)濃度成正比,可根據(jù)750nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。

 
 

 

 
 

3. Bradford法又稱為考染法。染料結(jié)合法測(cè)定蛋白質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度較高,可檢測(cè)到微量蛋白,操作簡(jiǎn)便,試劑配制極簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,但干擾因素多??捡R氏亮藍(lán)G-250具有紅色和青色兩種色調(diào)、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色,當(dāng)它通過(guò)疏水作用與蛋白質(zhì)結(jié)合后,變成藍(lán)色,大吸收波長(zhǎng)從465nm轉(zhuǎn)移到595nm處,在一定的范圍內(nèi),蛋白質(zhì)含量與595nm的吸光度成正比,測(cè)定595nm處光密度值的增加即可進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量。

 
 

 

三者之中,Lowry法與BCA同屬化學(xué)法,Lowry法是藥典中使用的蛋白濃度測(cè)定方法,但是操作繁瑣,實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)。BCA法操作簡(jiǎn)單,時(shí)間短,形成的顏色復(fù)合物穩(wěn)定性強(qiáng),但可能受一些雜質(zhì)影響。Bradford屬于染料結(jié)合法,也易受到去垢劑影響。

 

蛋白變性

蛋白變性常用方式是高溫煮樣,煮樣條件設(shè)置為100℃,根據(jù)樣品量的多少,設(shè)置時(shí)間5~15min,煮樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng),一些蛋白可能會(huì)產(chǎn)生聚集性沉淀。疏水性*的蛋白質(zhì),如含有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),在煮沸時(shí)可能會(huì)發(fā)生聚集或寡聚化,因此,其煮樣條件為40℃~55℃條件下,溫浴10~60min變性。煮樣后的樣本于-20℃或-80℃保存。

提取并定量后,并未加Loading Buffer煮樣的蛋白樣品,保存于-80℃時(shí),防止反復(fù)凍融,并盡量于1周內(nèi)加Loading Buffer煮樣處理,不要超過(guò)2周。

 

在此,為了幫您更好地完成實(shí)驗(yàn),我們推薦索萊寶蛋白定量和蛋白變性相關(guān)的配套產(chǎn)品。

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號(hào)

Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒

PC0010

BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒

PC0020

Lowry法蛋白濃度測(cè)定試劑盒

PC0030

4×蛋白上樣緩沖液

(含DTT)

P1015

4×蛋白上樣緩沖液

(含巰基還原劑)

P1016

4×非變性蛋白上樣緩沖液

P1017

 

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