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敲黑板 這些免疫組化FAQ助您攻破實驗難點

 免疫組織化學(簡稱免疫組化)是組織化學的一種,它是利用已知的特異性抗體與抗原能特異性結(jié)合的特點,通過化學反應使標記于結(jié)合后的特異性抗體上的顯示劑,如酶、金屬離子、同位素等,顯示一定的顏色,并借助顯微鏡觀察其顏色的變化,從而在抗原抗體結(jié)合部位確定組織、細胞結(jié)構(gòu)的化學成份或化學性質(zhì)。

 實驗過程包括切片制作(固定,脫水,透明,包埋,切片,貼片,烤片),脫蠟,水化,阻斷,抗原修復,封閉,一抗孵育,二抗孵育,顯色,復染,封片,分析。

 
 
 

IHC是一項具有挑戰(zhàn)性的應用技術(shù),應用過程中常出現(xiàn)各種問題,例如檢測結(jié)果陰性,非特異性染色,染色強度不夠,著色不均,脫片,干片等。因此索萊寶為大家總結(jié)了一些IHC常見問題及處理方法,來幫助您改進IHC檢測,減少您的實驗優(yōu)化過程,快速達到預期結(jié)果。

 

 

IHC常見問題

 

Q

固定液的選擇

A:

a)甲醛:甲醛是保留組織和細胞內(nèi)蛋白靶點的常用固定劑,是大多數(shù)IHC/ICC應用的良好選擇,但并不是一種通用的固定劑。醛的過度固定會修飾氨基酸(屬于表位中的一部分),并阻斷抗體與之結(jié)合。然而大部分情況下,利用抗原修復技術(shù)可暴露表位,以還原抗體結(jié)合。研究表明甲醛會誘導磷酸化依賴表位的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位,從細胞膜轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)。在這種情況下,冰預冷的無水甲醇或無水乙醇是適當?shù)奶娲?/p>

b)醇類:常用于細胞和組織固定的醇類是甲醇和乙醇。通常認為醇類不像甲醛固定劑那樣保留組織形態(tài),不像甲醛那樣滲透,主要用于固定冰凍組織切片和細胞。在醇類固定之后不推薦進行抗原修復。

c)丙酮:丙酮是一種強的脫水劑,能引起組織蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷凍組織的切片。

 

Q

細胞和組織常用的固定方法

A:

a)培養(yǎng)細胞:培養(yǎng)細胞的固定時間與組織相比較短,且固定液的濃度更低。例如,用2%甲醛溶液在室溫下固定20min,足以保留細胞形態(tài)和抗原性。

培養(yǎng)細胞的固定通常只是去除培養(yǎng)基,并加入固定液即可。不過,去除培養(yǎng)基后表面張力的變化可能損害某些細胞類型。如果是這種情況,固定劑可直接加入培養(yǎng)基中。例如,加入與培養(yǎng)基相同體積的4%甲醛,將得到2%甲醛溶液,它足以預固定細胞。2min后,預固定培養(yǎng)基應當替換成新鮮的2%固定劑。預固定步驟讓細胞更加堅硬,這樣它們就能夠承受表面張力改變所引起的任何可能的有害影響。

b)組織:對于小組織來說,浸入固定溶液通常能獲得足夠的固定。可將解剖的組織浸潤在固定劑中,但是如果將固定溶液經(jīng)由內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)(無論是通過心臟或通過腹主動脈)灌注,則往往能獲得更快速、更均勻的固定。在研究小動物的完整組織時,灌注固定是保留抗原的方法,包括用固定液來取代動物的全身血液。4%甲醛是組織灌注和浸潤固定的常用溶液。

為了在浸潤固定過程中加強固定劑的滲透,建議組織厚度不超過5mm。對于完整的固定,固定劑的體積應當是組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進行4-24小時。由于固定不足或固定過度可能降低或破壞組織的免疫反應性,因此優(yōu)化條件很重要。

 

Q

抗原修復方法

A:

由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中,發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用,從而掩蓋抗原決定簇,通過抗原修復,使得細胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露,提高抗原檢測率。常用的修復方式一般分三種:高壓修復、微波修復、酶修復。

a)高壓修復是目前使用較多、較穩(wěn)定、可重復性較高的一種方法,操作簡單,效果較好。但這種方法對修復的溫度和時間要求十分嚴格。我們常用的高壓鍋修復,溫度在110℃左右,修復時間為2.5min。

b)微波修復是較早采用的熱抗原修復技術(shù),其方法受環(huán)境因素影響較大。微波修復偶爾也會出現(xiàn)同時修復的組織切片中以及同一切片的不同部位可能會出現(xiàn)修復效果不均勻的現(xiàn)象。比較適合高pH值的抗原修復液(EDTA、EGTA)修復。

c)酶修復法比較溫和,常用于脫片現(xiàn)象較嚴重的切片(如骨組織切片)。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。酶消化法進行抗原修復,須嚴格控制濃度和作用時間,消化不足,不能充分暴露出組織抗原;過度的消化會破壞組織結(jié)構(gòu),陽性定位不明確。我們常用蛋白酶K修復,條件為37℃ 10min。

 

Q

為什么要滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性?

A:

內(nèi)源性過氧化物酶會與基質(zhì)溶液(過氧化氫和顯色劑,例如DAB)發(fā)生反應,導致假陽性。在與HRP偶聯(lián)抗體一起孵育之前,先用過氧化氫預處理樣本可以顯著降低這種非特異性背景。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫孵育10min左右。

 

Q

IHC實驗中有脫片現(xiàn)象

A:

 

Q

IHC染色出現(xiàn)定位不準確現(xiàn)象

A:

 

Q

染色后有邊緣效應

A:

 

Q

IHC實驗存在非特異性染色或顯色過度

A:

 

Q

IHC染色結(jié)果顯色較弱

A:

 

Q

IHC實驗染色結(jié)果是陰性

A:

 

Q

IHC實驗染色不均勻

A:

 



抗體驗證結(jié)果

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