1. 裝載探針 對(duì)于刺激時(shí)間較短(通常為2小時(shí)以內(nèi))的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)(通常為6小時(shí)以上)的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。 原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1毫升。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。
收集細(xì)胞后裝載探針：按照1:1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10微摩爾/升。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)二千萬(wàn)/毫升，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3-5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通?；钚匝蹶?yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20-30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。 說(shuō)明：僅在陽(yáng)性對(duì)照孔中加入Rosup作為陽(yáng)性對(duì)照，其余孔不必加入Rosup。
2. 檢測(cè) 對(duì)于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。對(duì)于收集細(xì)胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用激光共聚焦顯微鏡直接觀察也可以。
3. 參數(shù)設(shè)置 使用488nm激發(fā)波長(zhǎng)，525nm發(fā)射波長(zhǎng)，實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。
4. 其它說(shuō)明 陽(yáng)性對(duì)照可以按照1:1000的比例使用。例如裝載好探針的細(xì)胞共1毫升，可以加入1微升的陽(yáng)性對(duì)照刺激。通常刺激后20-30分鐘內(nèi)可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞，活性氧陽(yáng)性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內(nèi)觀察不到活性氧的升高，可以適當(dāng)提高活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。如果活性氧升高得過(guò)快，可以適當(dāng)降低活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。 另外，對(duì)于某些細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)沒(méi)有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng)，可以按照1:2000-1:5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時(shí)DCFH-DA的濃度為2-5微摩爾/升。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15-60分鐘內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。
活性氧陽(yáng)性對(duì)照(Rosup)僅僅用于作為陽(yáng)性對(duì)照的樣品，并不是在每個(gè)樣品中都需加入活性氧陽(yáng)性對(duì)照。
